Prof. dr hab. Zbigniew Szewczuk Wrocław, 2012-02-14 Wydział Chemii Uniwersytetu Wrocławskiego 50-383 Wrocław, ul. F. Joliot-Curie 14 e-mail: zbigniew.szewczuk@chem.uni.wroc.pl Recenzja rozprawy doktorskiej mgr Agnieszki Marii Głowińskiej p.t. „Synthesis of opioid-peptide platinum(II) complexes with potential antiproliferative activity” Niedostateczna skuteczność konwencjonalnej terapii antynowotworowej związana jest z niską specyficznością obecnie stosowanych leków cytostatycznych wobec komórek nowotworowych. Skutkuje to toksycznością w stosunku do zdrowych komórek, co naraża pacjenta na długotrwały i wyniszczający proces terapeutyczny, prowadzący do zaburzenia wielu funkcji fizjologicznych. Dlatego w wielu ośrodkach naukowych na świecie intensywnie poszukuje się nowych leków działających możliwie jak najbardziej specyficznie, a docelowo wyłącznie na komórki nowotworowe. Racjonalne projektowanie skuteczniejszych środków farmakologicznych do walki z rakiem wymaga poznania budowy i funkcji biologicznych komórek nowotworowych na poziomie molekularnym. Niezwykle istotne jest zrozumienie roli oddziaływań receptorów znajdujących się na powierzchni komórek nowotworowych z licznymi ligandami w patogenezie choroby. Wiedza ta jest niezbędna do zaprojektowania i syntezy nowych klas cytostatyków, możliwych do zastosowania w tak zwanych "terapiach celowanych", skuteczniejszych i miej inwazyjnych od obecnie stosowanych. Pani mgr Agnieszka Głowińska włączyła się w nurt tych badań i pod kierunkiem dr hab. Aleksandry Misickiej, Prof. U.W. wykonała pracę doktorską poświęconą syntezie chemicznej dwufunkcyjnych analogów peptydów opioidowych wiążących cisplatynę jako potencjalnych leków o ukierunkowanym działaniu przeciwbólowo-przeciwnowotworowym. W moim przekonaniu, tematykę badawczą mgr Głowińskiej należy uznać za aktualną i bardzo ważną zarówno z poznawczego jak i utylitarnego punktu widzenia. Rozprawa doktorska mgr Głowińskiej jest 277-stronicowym manuskryptem napisanym w języku angielskim. Składa się z tradycyjnych części: Abbreviations, Introduction, Global Objectives, Results and Discussion i Experimental Part. Rozprawę kończy spis literatury - References zawierający 167 odnośniki literaturowe. Do manuskryptu dołączono również cyfrową wersję polskojęzycznego Streszczenia Pracy Doktorskiej. Wstęp teoretyczny zawiera wszystkie informacje niezbędne do uzasadnienia celu pracy. W rozdziale tym zawarto informacje o cisplatynie, jej działaniu biologicznym i zastosowaniu w terapii antynowotworowej. Przedstawiono organiczne ligandy platyny(II) ze szczególnym uwzględnieniem aminokwasów i peptydów. Następnie omówiono wybrane zagadnienia dotyczące projektowania leków, w tym: systemu dostarczania leków, metod zwiększania ich rozpuszczalności i zastosowania aktywnych nośników. Dalsze części wstępu dotyczą syntezy kompleksów platyny i ich analizy. Wysoko oceniam tą część rozprawy i uważam, że świadczy ona o dużej wiedzy Doktorantki. Autorka jednak nie ustrzegła się od kilku błędów. Chemika mogą razić pomyłki we wzorach chemicznych przedstawionych na Schematach: 2 (str. 17), 6 (str. 30), 7 (str. 31), 8 (str. 31) oraz nazwach w Tabeli 4 (str. 47). Należy jednak podkreślić, że są to oczywiste błędy i nie umniejszają wartości merytorycznej tej części rozprawy. Założenie pracy doktorskiej jest bardzo racjonalne. Doktorantka wykorzystała wnioski innych badaczy, sugerujące istnienie wyjątkowo dużych ilości receptorów opioidowych na powierzchni komórek nowotworowych. Na tej podstawie zaprojektowała potencjalne leki przeciwnowotworowe, których cząsteczki zawierały segmenty odpowiedzialne za pełnienie różnych funkcji. Pierwszy segment zawierał sekwencję peptydowego lub peptydomimetykowego liganda receptorów opioidowych (enkefaliny, endomorfiny-2 TAPPu lub bifaliny). Miał on zapewnić selektywność leku przez specyficzne wiązanie się z receptorami opioidowymi na powierzchni komórek nowotworowych i jednocześnie wywoływać działanie przeciwbólowe przez oddziaływanie z komórkami układu nerwowego. Drugi segment, zlokalizowany na końcu C cząsteczki zawierał kompleks aminokwasowego liganda z jonem platyny(II), był odpowiedzialny za działanie antynowotworowe. Dodatkowym elementem budowy chemicznej takich dwufunkcyjnych połączeń były odpowiednio zaprojektowane grupy hydrofilowe, mające zwiększyć rozpuszczalność w rozpuszczalnikach wodnych. Synteza serii substancji zawierających różne kombinacje segmentów opioidowych i kompleksujących jony platyny były głównym celem recenzowanej rozprawy. Związki te zostały poddane odpowiednim testom biologicznym w celu określenia wpływu poszczególnych elementów zaprojektowanych struktur chemicznych na działania biologiczne. Uważam, że Doktorantka miała okazję do realizowania bardzo dobrze przemyślanego projektu badawczego, w dobrze wyposażonym laboratorium chemicznym pod kierunkiem doświadczonego Promotora, Pani Profesor Aleksandry Misickiej, mogącej się poszczycić wieloma sukcesami w dziedzinie chemii peptydów. W moim przekonaniu Doktorantka prawidłowo wykorzystała stworzone Jej warunki. Z części doświadczalnej wynika, że wszystkie opisane w pracy eksperymenty syntetyczne i biologiczne zostały prawidłowo zaprojektowane i wykonane. Doktorantka przeprowadziła syntezy większości peptydów opioidowych na nośniku stałym, natomiast analogi bifaliny zsyntezowała w roztworze. Otrzymane peptydy poddała reakcji kompleksowania z jonami platyny(II). Do oczyszczania zsyntezowanych peptydów i ich kompleksów Doktorantka wykorzystała wysokosprawną chromatografię cieczową. Otrzymane substancje zostały badane za pomocą spektrometrii mas z elektrosprejowym źródłem jonów a następnie zostały poddane odpowiednim testom biologicznym na celu określenie ich aktywności opioidowej i antyproliferacyjnej. Wiązania otrzymanych przez Doktorantkę peptydów do receptorów opioidowych µ i . zostały zbadane przez pracowników zespołu naukowego profesora Andrzeja Lipkowskiego. Natomiast właściwości antyproliferacyjne otrzymanych pochodnych względem komórek nowotworowych T98G przeprowadziła przez dr Marzena Łazarczyk z zespołu profesor Ewy Matyji. Wyniki tych badań pozwoliły wskazać kompleksy peptydowe wykazujące duże powinowactwo do badanych receptorów i wykazujące aktywność antyproliferacyjną. Doktorantka wykazała, że cząsteczki aktywnych peptydów charakteryzują się obecnością małych pierścieni chelatowych. W moim odczuciu charakterystyka otrzymanych przez Doktorantkę związków chemicznych przedstawiona została zbyt lapidarnie. Trudno oprzeć się wrażeniu, że Autorka rozprawy wolała się skoncentrować na wynikach badań biologicznych, których nie przeprowadzała osobiście, natomiast zaniedbała stronę syntetyczną swojej rozprawy, którą sama wykonała. Uważam, że wyniki badań analitycznych zsyntezowanych przez Doktorantkę substancji powinny być lepiej udokumentowane. Wskazane byłoby przedstawienie widm masowych otrzymanych substancji. Szczególnie istotne byłoby pokazanie poszerzonych obszarów widm zawierających obwiednie izotopowe dla otrzymanych kompleksów z jonami platyny. Dokładna analiza takich obwiedni pozwoliłaby potwierdzić wzory strukturalne otrzymanych połączeń i wskazać ewentualne zanieczyszczenia. Proszę także Doktorantkę o wyjaśnienie co rozumie pod pojęciem "m/z" i dlaczego w wielu wynikach analiz pojawia się stosunkowo duża (nawet ponad 0,5 Th) różnica pomiędzy wartością m/z obliczoną i znalezioną. Wątpliwości mogą też budzić przedstawione w rozprawie interpretacje uzyskanych widm. Na przykład nie jest jasne, na jakiej podstawie Autorka twierdzi na str. 197, że sygnał przy 971 odpowiada [M-Cl+H+], skoro utrata jednego anionu chlorkowego i przyłączenie protonu powinno spowodować powstanie jonu obdarzonego ładunkiem +2, co powinno zmienić wartość m/z. Jeszcze większe zastrzeżenia budzi interpretacja widma MS dla peptydu H-Tyr-D-Ala-Gly-Phe-Lys(D- Glc)-Met-OH (str. 161). Wydaje się nieprawdopodobne, że sygnał przy 934,7 odpowiada [M+MeOH+H+], tym bardziej, że eksperyment był wykonany w wodnym roztworze acetonitrylu a nie w metanolu. Autorka powinna przedstawić informacje o wydajności syntez dla wszystkich otrzymanych związków i ich czystości. Przechodząc do strony formalnej rozprawy, należy zwrócić uwagę na estetyczny wygląd manuskryptu. Anglojęzyczny tekst rozprawy doktorskiej mgr Głowińskiej został napisany w sposób zrozumiały. W recenzowanej rozprawie doszukałem się kilku drobnych błędów literowych. Nie wszystkie skróty zostały wyjaśnione w rozdziale Abbreviations a użycie niektórych z nich budzi wątpliwości. Mam także zastrzeżenia do nazw niektórych związków chemicznych. Uwagi te wyjaśnię w trakcie dyskusji z Doktorantką. Należy jednak podkreślić, że usterki te nie umniejszają wartości naukowej recenzowanej rozprawy. Pracę doktorską mgr Głowińskiej oceniam pozytywnie. Autorka wykazała się umiejętnością posługiwania się nowoczesnymi metodami syntezy organicznej i prawidłowej interpretacji uzyskanych wyników badań biologicznych. Uzyskała też wiele wartościowych i ciekawych rezultatów, które poszerzają naszą wiedzę w zakresie chemii peptydów. Badania biologiczne przeprowadzone na związkach chemicznych zsyntezowanych przez Doktorantkę mogą być pomocne w projektowaniu nowych leków przeciwnowotworowych. W podsumowaniu pragnę podkreślić, że rozprawa doktorska mgr Agnieszki Głowińskiej stanowi cenny wkład naukowy i spełnia wszystkie wymagania określone w Ustawie z dnia 14 marca 2003 r. o stopniach i tytule naukowym (Dz. U. z dnia 16 kwietnia 2003 r.). Dlatego stawiam wniosek do Rady Naukowej Wydziału Chemii Uniwersytetu Warszawskiego o dopuszczenie mgr Agnieszki Głowińskiej do dalszych etapów przewodu doktorskiego.